مقاله مقدمه ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی با word

توضیحات

 مقاله مقدمه ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی با word دارای 55 صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد مقاله مقدمه ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی با word  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله مقدمه ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی با word،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد

بخشی از متن مقاله مقدمه ای بر بیوتكنولوژی انتقال ژن در ماهی با word :

مقدمه:
یكی از زمینه های كه امروزه بیوتكنولوژیست ها روی آن تحقیق می كنند ایجاد گونه های ترانسژنیك است. طبق تعریف ترانسژنیك موجودی است كه، دارای DNA نو تركیبی باشد. به طوری كه در ژنوم آن موجود ژن نو تركیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یكی از جنبه های تولید ترانسژنیك و انتقال DNA به زاده های هدف بعدی می باشد. در این زمینه تكنیك میكرواینجكش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همكاران در سال 1980 گزارش شد. در این تكنیك یك لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد كردن DNA نو تركیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به كار گرفتند. در همین سال میكروانجكش مستقیم DNA نو تركیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیك مورد استفاده قرار گرفته است. طوری كه ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته

موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سركه، خرگوش و خوك كرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همكاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مركزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق كردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده كرند. در همین سال روكونس (Rokkones) تكنیك میكرواینجكشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تكنیك ابتدا به كمك یك وسیله نوك تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA نو تركیب به كمك پی پت ریز تخم شدند به طوری كه به كیسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسمیدهای كامل را مشخص كردند. چوروت (Chourrout) و همكاران در سال 1986 روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به كار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملكولهای DNA میزبان پیشنهاد شده كه این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از جمله با تریپسن

كوریون را برداشته و تزریق میكرواینجكشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی كوچك مدوكا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیك مطرح كرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن كریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میكرواینجكشن وارد كرد. به علت كوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میكرواینجكشن مشكل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور روشهایی جهت غلبه بر این مشكل به كار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بریم (Brem) و همكاران ژن هورمون رشد انسان را به كمك وكتور مناسب از طریق میكروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق كردند و رشد بچه ماهیان طی 90 روز بررسی شد. مشابه این

تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همكاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیك انجام شد. همچنین تكنیكهای دیگر شامل الكتروپورشن (Electroporation) شلیك ذرات ژن Shatagun بر روی تخمك و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میكر واینجكشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن كم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیك است علاوه بر این از دیگر مشكلات آن این است كه در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میكرسكوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم تزریق می كنند.

در مجموعه تحقیقات انجام شده، میزان باقی ماندگی جنین هایی كه مورد تزریق قرار گرفته اند بین 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و كارآیی میزان بیان ژن بین 3 تا 70 درصد بوده است. باقی ماندگی جنین ها و كارایی بیان ژن وابسته به فاكتورهایی نظیر سیستم بافری، غلظت DNA و روش های مورد استفاده در تزریق می باشد. لذا در مراحل بعدی غلبه بر این مشكلات مورد توجه قرار گرفت به طوری كه ضمن ساده كردن تكنك و كم كردن هزینه ها كارآیی را افزایش می دهند تا در عمل بتوان در تكنولوژی تكثیر و پرورش آبزیان تعداد زیادی از ماهیان ترانسژنیك را ایجاد كرد. بنابراین روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بكارگیری اسپرم به عنوان یك ناقل مسئله جدیدی نیست بلكه در سال 1971 براكت (Brackett) با وارد كردن ژن خارجی به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فریمن (Fareeman) بر روی ماكیان این تحقیق را انجام داده اند و در سال 1989 لویترانو (Lavitrano) این تكنیك را بر روی موش به كار گرفته است. در سال 1992 كهو (Khoo) تكنیك استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد كردن ژنهای جدید به ماهی زبر به كار گرفت. همچنین در سال 1993 ایكسی (Xie) و همكاران جزئیات انتقال ژن از طریق اسپرم به كمك التروپورشن (Electroporation) بر روی ماهیان لوچ (Loach) و كاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سین) Sin و همكاران انتقال ژن به ماهی چنوك (Chinook) را با همین تكنیك شرح دادند. در این نوشتار جزئیات دستكاریهای ژنی در ماهیان با ذكر مثالهایی بررسی شده است.
1-1- به كار گیری پروموتر از ژن ماهیان
گزارشهای اندكی در ارتباط با تحقیقات به كارگیری پروموتر از ماهی در دسترس است. در ماهی قزل آلای رنگین كمان دو فرم مشابه از ژنهای متالوتیونین بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بیان ژن گزارشگر در محیطهای كشت سلولی است. ولی درباره این ویژگی پروموترژن B در سلولهای ماهی اطلاعات كمی وجود دارد. به منظور طراحی و كتورهای مناسب برای ما هی و مطالعه تنظیم بیان ژن در داخل بدن و شرایط آزمایشگاهی پروموترن ژن B متالوتیونین ماهی قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بیان ژن در لاینهای سلولی انسان و ماهی توسط هونگ (Hong) به كار گرفته شد. به همین منظور وكتور بنام PtMTb – CAT كه دارای 6/4 كیلوباز است

طراحی گردید. حدود 261 حفت باز وكتور مربوط به پروموترژن B متالتیونین قزل آلای رنگین كمان (tMTb) كیلو باز آن ژن كلرامفنیكل استیل ترانسفراز (CAT) و سیگنال پلی ادنیلاسیون ویروس SV40 و همچنین 7/2 كیلو باز آن قطعه ای مربوط به پلاسمید PUC18 بوده است همچنین طراحی آن بر پایه ساختمان pBL – CAT تكمیل شده بود. به طوری كه طراحی BL پرایمری دارای سكانس اولیگونكلئوتیدی بر اساس ردیف نكلئوتیدهای سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهی قزل آلا بوده و دارای محل ویژه ای جهت

برش توسط آنزیم EcoRI بوده است. همچنین در ساختمان پلاسمید ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازی پروموتر tMTb در جلوی ژن CAT در ساختمان CAT pBL- قرار گرفته است. در كنار این چهار وكتور دیگر طراحی گردید، كه شامل pBL-CAT2-1 كه در آن پروموتر تیمیدین كیناز (TK) ویروسی در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT3-2 بر اساس pBL-CAT2 كه در آن پروموتر TK برداشته بود طراحی شد pTK-CAT2E-3 كه در پلاسیمید PBL-CAT2 تعداد 72 جفت باز تكراری از اینهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتدای ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 كه تعداد 850 جفت باز دارای محل ویژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتیونین IIA انسانی (HmtIIA) به ژن CAT در ساختمان

pBL-CAT3 اضافه شده بود این وكتورها به روی 4 لاین سلولی ماهی و یك لاین انسانی به كار گرفته شدند. طوری كه در آن سلولها با میزان 5/3 پیكومولار از DNA پلاسمید آلوده شدند جزئیات نتایج در جدول شماره یك آمده است.
جدول 1- سنجش فعالیت پروموتر در یك لاین سلولی انسان و چهار لاین سلولی ماهی

Cell lines Constructs
‍PSM A2 EPC RTH HepG2
0.43
n.b.c
100.00
0.55
0.43
(0)
0.40
(0)
0.96
13.26
(13.84)
5.66
(5.91) 0.52
n.b.c
100.00
0.74
4.53
(6.16)
11.62
(15.80)
3.71
99.28
(26.64)
98.12
(26.33) 0.27
3.67
100.00
0.5
10.95
(21.9)
1.02
(2.04)
3.68
139.00
(37.77)
106.67
(29.00) 1.16
3.14
100.00
1.40
39.11
(27.94)
7.18
(5.13)
14.11
480.69
(34.07)+227.48
(16.12) 0.13b
1.00
100.00
0.10
0.33
(3.30)
0.11
(1.10)
1.21
72.56
(69.20)
13.90
(11.50) pBL – CAT3
pBL – CAT2
pTK-CAT2E
ptMTb CAT
+zinc

+cadmium

phMTIIACAT
+zine

+cadmium

EPC (Carp epithelioma Papulosum) , PTH (Rainbaw trout hepatoma)
Hep (Human hepatoblastoma) , PSM (Xiphophorus interspecific melanoma) , A2 (xiphophorus xiphidium emryonal epitheloid )
جهت بررسی اثرالقاء فلزات بر روی ژن، لاین های سلولی ماهی آلوده با پلاسمید ptMTb- phMTIIA – CAT , CAT برای مدت 48 ساعت قبل از برداشت، تحت اثر ZnCI2 یا CdCI2 قرار داده شدند. سنجش CAT بر طبق روش فریدین ریچ (Friedenreich) در سال 1990 انجام شده كه در آن فعالیت پروموتر به وسیله درصد تبدیل CAT با مقایسه استیل كلرامفنیل (3-Ac) و كلرامفتیكل (Cm) به شرح زیر تعیین شد.

پروموتر tMTb در تمام لاین های سلولی به جز لاین سلولی PSM فعال بوده است. بنابراین القاء ناشی از فلزات بر روی پروموتر tMTb بستگی به منشاء سلولها و نوع آنها دارد علاوه بر این در بین چهارلاین سلولی بیشترین القاء در فعالیت پروموتر در لاین سلولی RTH بوده است و لاینهای A2 , EPC در مراتب بعد قرار داشتند. این نتایج در كنار این حقیقت كه در مهره داران سنتز عمده متالوتیونین در كبد اتفاق میافتد نشانگر این است كه، این تكنیك میتواند روشی برای ابزار ژن متاتیونین در سایر انواع سلولها باشد. همچنین پلاسمید tMTb= CAT‍‍‍‍ ‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍p را به سیتوپلاسم یكی از دو سلول مرحله جنینی ماهی مدوكا از طریق میكرواینجكش تزریق كردند و مشاهده شد كه ژن CAT در

تعداد محدودی از جنین ها براز شده است. تحقیقات هونگ و همكاران نشان داد كه، پروموتر ماهی در سلولهای ماهی كارایی بیشتری از سایر سلولها نظیر انسان داشته استم. محدودیتهای زیادی در استفاده از پروموترهای چند گانه غیر متجانس (Heterologous) برای مطالعات ابزار ژن در شرایط زیستی و آزمایشگاهی در زمینه تولید ماهیان ترانسژنیك وجود دارد. با توجه به اینكه پروموتر tMTb نقش غیر محسوسی در بیان ذاتی ژن داشته است طوری كه تحت اثر فلزات سنگین القاء شده و سبب ابزار ژن گزارشگر می شود. این پروموتر، برای ایجاد ماهیان ترانسژنیك با ژن ساختمانی شناخته شده و فهم عمل ژنهای جدید مناسب است.

2-1- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باكتریچ
هورمون رشد یك پلی پپتید تك زنجیره است كه به وسیله هیپوفیز پیشین تولید و ترشح می شود. در مهره داران اولین نقش هورمون رشد افزایش رشد سوماتیكی است علاوه بر این ماهیان استخوانی این هورمون در تنظیم شرایط اسمزی و تعادل الكترولیتی بدن و چندین عمل متابولیكی دیگر نقش دارد. ساختار ژن هورمون رشد و بیان آن، از مدلهای مهم برای مطالعه رابطه سا ختمان و عمل پروتئین و تنظیم بیان ژن است، طی تحقیقی كه سال 1993 توسط سونگ (Song) و همكارانش انجام شد جداسازی

ژن هورمون رشد و تولید پلی پپتید آن به میزان بسیار زیاد در میكروارگانیسم ها بررسی شد. در سالهای اخیر در بسیاری از ماهیان این ژن از طریق cDNA كلون شده است. از جمله در یكی از فعالیتهای تحقیقاتی ژن هورمون رشد ماهی آزاد چنوك (Chinook salmon) از این طریق جدا و به باكتری اشیرشیاكلی تزریق شده است (Song 1993) در این تكنیك ابتدا cDNA هورمون رشد و جدا و كلون شد. cDNA 2/1 كیلو جفت باز بوده و در ساختار pSGH4 طراحی شد. سپس دو تا پروب الیگونكلئوتیدی و پرایمر برا‌ی آن ساخته شد.

طراحی پروبها و پرایمرها بر اساس ردیف اسیدهای امینه به روش باندهای فسفر دی استری روی فاز جامد انجام گرفت. پروب A بر اساس ردیف رزیدوهای 7-1 و پرب B بر اساس رزیدوهای 172-166 طراحی شدند و به وسیله الكتروفورز روی ژل اكریل آمید خالص گردیدند. همچنین طراحی پرایمرهای 1و2 بر اساس الگوی cDNA انجام شد. سپس آمپلی فیكاسیون ژن هورمون رشد به وسیله PCR انجام و محصولات PCR به وسیله الكتروفورز روی ژل آگاروز چك و با اتانل رسوب داده شدند و در قدم بعدی پلاسمید لازم برای بیان ژن طراحی گردید. و ژن مدیفای شده cDNA هورمون رشد به وسیه آنزیمهای برش دهنده Bam HI , Eco RI برش به ناقل پلاسمیدی كه آن هم به وسیله همین آنزیمها برش شده بود منتقل شد.

سپس پلاسمید طراحی شده به باكتری Ecoli JM105 وارد گریدند نو تركیب به وسیله پروب نشانه گذاری شده A مشخص شدند. كلونهای كه ژن به آ‌نها وارد شده بود. به نام pmAK5 نامیده شدند. اگر چه جهت تأئید بیشتر مجدد این كلونها تحت اثر آنزیمهای برش دهنده قرار داده شدند و با پروب نشانه B هیربد شدند. سپس اشیرشیا كولی های Ecoli K12 – JM105 حاوی پلاسمید pmAK5 كه دارای ژن هورمون رشد بودند در محیط كشت YT كلون شدند. پس از انكوباسیون باكتریها با ایزوپروپیل دی تیوگالاكتو پیرانوزید (IPTG) برای مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه، سلولها جدا و در بافر لایملی (Laemmli 1971) حل و با SDS-PAGE و كماسی بررسی شدند. نتایج نشان داد كه به طور تخمین میزان 10-6 درصد از مجموع تمام پروتئین سلولی در اشیرشیاكولی مربوط به ژن هومون رشد بوده است.

3-1- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میكروپیل با میكروپیپت
در سال 1998 بریم و همكاران در تحیقیقی ژن هورمون رشد انسان را از طریق میكروپیل به صفحه زایای ماهیان تیلاپیا انتقال دادند رشد ماهیان طی 90 روز بررسی شد. جهت تكثیر، تعداد 4 یا 5 ماهی ماده را در كنار یك ماهی نر قرار دادند به طوریكه در شرایط آ‌زمایشگاهی تخمك گذاری ماهیان ماده انجام و با اسپرم لقاح شدند. تخم های لقاح یافته 10 دقیه پس از تخمك گذاری در شرایط مصنوعی برداشته شدند. تمام تخم ها به انكو باتورهای ویژه با جریان آب و دمای منتقل شدند و تا زمان دست كاری نگهداری گردیدند. تزریق به تخم ها در زمانهای 10 دقیقه و 24-21 و 43-40 ساعت پس از تخمك گذاری انجام شد. ساختار پلاسمیدی كه در انتقال ژن به تیلاپیا به كار

گرفته شد بنام 1- pXGH در تصویر 4 نشان شده است. این پلاسمید دارای 31/9 كیلوباز شامل 35/2 كیلو باز از قطعه ای از BPV-1 كه دارای دو محل ویژه برش توسط آنزیمهای EcoRI , Bam H1 می باشد. تصویر 4- ساختمان پلاسمید pXGH-1 و جایگاههای مورد شناسایی آنزیمهای برش دهنده از طرف دیگر 46/2 كیلو باز آن از قطعه ای از پلاسمید pBR322 و 4 كیلو باز آن كه دارای دو محل ویژه برش توسط Eco RI در دو انتهای خود می باشد مربوط به پروموترمتالوتیونین موش mMTI و ژن هورمون رشد انسان ‌hGH كه به آن متصل كرده اند بوده است. اگر چه از این مقدار 8/1 كیلو باز آن مربوط به پروموترژن متالوتیونین موش و 7/1 كیلو باز آن مربوط به ژن ساختمانی

هورمون رشد انسان بوده است. در ژن هورمون رشد نواحی اگزون و انترون و ترتیبات غیر قابل ترجه در طراحی شده بود همچنین در سمت ژن هورمون رشد انسان قطعه ای به اندازه 5/0 كیلو از فاژ طراحی شده كه دارای محلهای ویژه ای جهت برش توسط آنزیمهای برش دهنده بوده است. علاوه بر این برای قطعه ای از ژن hGH كه در اثر برش توسط دو آنزیم Bg1 II , Pvn II ایجاد می شود پروب طراحی شده بود تزریق در یك پتری دیش پر از آب به كمك استریومیكروسكوپ (Wild M8) و دو پیپت انجام شد. تخم ها به كمك یك میكروپیپت نگهدارنده كه سر آن به شكل فنجان طراحی شده بود مكش و تثبیت و از حركت آنها به طرفین جلوگیری شد. سپس به كمك میكروپیپت دوم به قطر 5 میكرومتر محلول حاوی DNA از طریق میكروپیل به صفحه زایای تخم ها تزریق شد. مقدار تقریبی 106 كپی از DNA به كمك فشار هوا به هر تخم تزریق شده است. جزئیات تزریق و هچ تا مرحله 90 روز در جدول شماره 2 ذكر شده است.

جدول 2- تعداد تخمهای مورد تزریق، هچ شده و ما هیان پس از 90 روز
Number of in
Jected fish (n)
Surviving to 90
Days of age (n) Hatching rate of in
Jected eggs (controls) Hatched Injected Time of injection
(after spawning)
5(25%)
18(51%)
44(98%)

67(67%) 66%
77%
90%

(75%) 20
35
45

100 30
45
50

125 10 min
21-24 h
40-43 h
در پایان 90روز از تعداد 18 ماهی باقی مانده از تخم هایی كه در فاصله زمانی 24-20 ساعت پس از تخم ریزی مورد تزریق قرار گرفته بودند فقط 3 تا از ماهیان سكانس ژن هورمون رشد را دارا بودند. یك قطعه از 44 ماهی باقی مانده از تخم هایی كه در فاصله زمانی 43-40 ساعت پس از تخم ریزی مورد تزریق قرار داده شده بودند، ترانسژنیك شده و سكانس ژن را داشته است. تیلاپیا از جمله ما هیانی است كه دارای كوریون سفت می باشد. به طوری كه نمی توان كوریون آن را به راحتی با میكروپیپت سوراخ

كرد بنابراین نیاز به دستكاریهای دیگر می باشد. ساده ترین و ضروری ترین راه غلبه برسد كوریون، تزریق از راه میكروپیل است كه این خود مستلزم نگهداری و تثبیت تخم می باشد. تخم را باید تا زمانی در زیر استریومیكروسكوپ چرخاند تا میكروپیل آن قابل روئیت شود. گاهی در یك آزمایش چندین تكرار لازم است تا میكروپیپت از راه مركز میكروپیل وارد شود. اگر چه در این تحقیق كه مورد دستكاری قرار داده شده اند در مقایسه با شاهد یكسان بوده است.
4-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با انكوبه كردن آن در سیستم بافری

كهو (khoo) و همكاران در سال 1992 گزارشی در خصوص ورود ژن خارجی از طریق اسپرماهی زبرا و بررسی اینكه آیا این ژن به نسل های بعد منتقل می شود ارائه كردند. در این تحقیق اسپرم را از ماهیان بالغ به دست آودره و آن را در محلول حاوی پلاسمید نو تركیب كه دارای ژن گزارشگر مورد علاقه بود انكوبه كردند. سپس این اسپرم برای لقاح تخمكهای ماده مورد استفاده قرار داده شد. جنین هایی به دست آمده حاصل از لقاح اسپرم حاوی ژن خارجی و تخمك تا مرحله بلوغ مراقبت شدند همچنین ژنومیك DNA آنها استخراج و بررسی حضور ژن خارجی منتقل شده با تكنیك ساترن بلوت انجام شد ژن گزارشگر مورد علاقه در این تحقیق مشابه پلاسمی

د استفاده شده توسط جونگ (Chong) در سال 1989 پلاسمید pUSV – CAT بوده است. ساختمان این پلاسمید در تصویر5 دیده می شود ژن گزارشگر كرامفنتیل استیل ترانسفراز (CAT) انتخاب شد. زیرا محصول این ژن به سرعت و به سادگی مورد آزمایش قرار می گیرد و علاوه بر این آنزیمی مشابه این در سیستم آنزیمی یوكاریوتها وجود ندارد. پلاسمید PUSV – CAT دارای ترتیبات تكراری برای اتمام از ویروس روزساكروما Rous sarcoma و پروموتر ویروس SV40 در شروع بوده است. مزیت استفاده از ماهیان زبرا جهت این آزمایشات به دلیل دوره كوتاه ایجاد نسل در آنها می باشد. به طوریكه تخم ها در عرض 3 تا 4 روز هچ می شوند و در فاصله زمانی 3 تا 4 ماه ماهیان بالغ می گردند. همچنین تولید ماهیان و نگهداری و مراقبت از لارو آنها در شرایط آزمایشگاهی امكان پذیر است. لقاح تخمك های ماهی زبرا با سلولهای اسپرم كه در معرض

پلاسمید نوتركیب قرار گرفته بودند انجام شد. جهت دست آوردن اسپرم نرهای بالغ به اندازه 4-3 سانتی متر و سن 4-3 ماه را تشریح كردند. سپس بیضه ها را جدا كرده و در 100 میكرولیتر بافر PBS قرار دادند. آنگاه آنها را در یك كاغذ پارافین قرار داده و به آرامی خرد كردند. سوسپانسیون هموژن تهیه شده از بیضه های را به اپندروفهای 5/1 میلی لیتری منتقل كردند. تكه های بافتی به وسیله سانتریفوژ با دور ‌g800 برای مدت یك دقیقه، در دمای اطاق جدا كردند. سپس محلول رویی را به اپندروفهای استریل دیگر منتقل كردند. به محلول رویی حاوی اسپرم 900 میكرولیتر از بافر PBS اضافه نمودند. در ادامه پس آنها را به مدت 3 دقیقه با دور 4000 سانتریفوژ كرده و محلول رویی را مجدداً جدا نمودند. این فرآیند را دو مرحله تكرار كردند. پس از شستشوی نهایی اسپرمها را در سپانسیون 25 میكرولیتری از بافر قرار دادند. به این سوسپانسیون آماده

پلاسمید pUSV-CAT كه به فرمهای خطی و حلقوی بود اضافه شد. پس از مخلوط كردن برای این مدت 30 تا 40 دقیقه در دمای 22 درجه سانتی گراد انكوبه گردیدند. سپس تخمكهای رسیده را از ماهیان ماده به دست آورده، در یك پتری دیش به دو قسمت مساوی تقسیم كردند، یك قسمت به آرامی با 25 میكرولیتر از سوسپانسیون حاوی اسپرم كه با یلاسمیدانكوبه شده بود و نصف دیگر آن را با اسپرم شاهد كه تحت تیمارپلاسمید قرار نگرفته بود لقاح دادند. به كمك نمونه برداری از لاروها خا در سن یك هفتگی و برش باله سینه ای از ماهیان بالغ DNA استخراج و بررسی به روش ساترن بلوتینگ روی DNA با كلرامفنیل نشانه دار به عنوان سربستر انكو به شود فرم

استیله شده آن تولید خواهد شد كه پس از جدا سازی بوسیله كروماتوگرافی قابل تشخیص است. نتایج نشان داد كه، پلاسمید حاوی ژن گزارشگر CAT در ماهیان و زاده های نسل بعد آن ظاهر می شود. سنجش آنزیمی CAT روی ماهیان و زاده ها نشانگر عدم ابرازژن به پلی پیتید بوده است. از طرف دیگر استیورات (Stuort) و همكاران در سال 1990 روش میكرواینجكشن را با همین پلاسمید بر روی همین گونه ماهی به كار گرفتند در این تحقیق ابرازژن به پلی پییتید صورت گرفت بنابراین عدم بیان ژن به

علت خصوصیات ذاتی ماهیان یا عدم شركت پروموتریلاسمید در رونویسی نمی باشد، اغلب باشد ممكن است ژنی كه با استفاده از ناقل اسپرم وارد می شود تغییر كرده و ترتیب جدیدی پیدا نماید به طوری كه ژن بیان نشود. این اختلاف در ابرازژن وابسته به دقایقی است كه در مقدمه ژن خارجی (پروماتور) صورت می گیرد در میكرواینجكشن استیورات، DNA پلاسمید در مرحله میتوز به میزبان معرفی شده است. تعداد دیگر از محققان با به كارگیری پلاسمیدها و كار روی سایر ماهیان نیز عدم بیان ژن را گزارش كرده اند. یكی از دلایل عدم بیان ژن ناشی از این است كه، پروموترو اینهنسر مورد استفاده در ماهی به عنوان نواحی شروع شناخته نمی شوند. به نظر نمی رسد كه شكل خطی بودن یا حلقوی بودن DNA برای انتقال آمیز ژن در ماهی تأثیری داشته باشد بلكه هر دو شكل DNA اثرات مشابهی از خود نشان می دهند.

تصویر 5- دیاگرام پلاسمید pUSV-CAT در آن قطعه RSV LTR , CAT و نواحی پروموتر و اینهسنر SV40 نشان داده شده است جایگاه برش توسط آنزیمهای برش دهنده شامل (Kpn I) K , (Ps II) P , (Sal I)S می با شد در اثر برش توسط آنزیم Ps II دو قطعه 63/4 و 24/3 كیلو جفت بازی ایجاد می شود.
5-1- انتقال ژن از طریق اسپرم با الكتروپورشن در سیستم بافری
در سال 1993 سین (Sin) و همكاران انتقال ژن به ما هی آزاد چنوك را از طریق اسپرم به كمك الكتروپورشن انجام دادند. برای این منظور از پلاسمید pRSV-LacZ استفاده كردند (تصویر 6) این پلاسمید آن LacZ و ناحیه اتمام

(Rous sarcama virus) RSV و قطعه ای از ژن SV40 و دو ناحیه برش توسط آنزیمهای Pst I , Hind III داشته است. سلولهای اسپرم جهت الكتروپورشن در شرایط دمای سرد ناشی از آب یخ در طی آزمایش نگهداری شند. حدود نیم میلی لیتر اسپرم با نیم میلی لیتر از باز HEPES حاوی 10 میكروگرم پلاسمید مخلوط كرده و آنها را در معرض پالس میدان الكتریكی با قدرت های متفاوت قرار دادن جزیئات نتایج در جدول شماره 3 بیان شده است.

نتایج نشان داد، كه در قدرت میدان 625 ولت بر سانتی متر و پالس 6/18 میلی ثانیه است نسبت ماهیانی كه پلاسمید را دریافت داشتند 2 به 20 بوده است. همچنین در قدرت میدان 1150 و پالس 6/18 این نسبت 1 به 20 بوده است. اگر اسپرم دارای تحریك پذیری (Motility) باشد خواهد توانست غشاء سیتوپلاسمی تخمك ارتباط برقرار كرده و به آن نفوذ نماید. بنابراین سنجش تحریك پذیری اسپرم شاخص مناسبی جهت تشخیص توانایی آن در لقاح است. این تحریك پذیری ممكن است تحت تأثیر رقیق كننده ها قرار گیرد. بیلارد (Billard) در سال 1993 نشان داد كه، رقیق كردن اسپرمها به نسبت به 1 به 100 برای داشتن 100 درصد اسپرم با تحریك پذیری مناسب جهت القاح لازم می باشد. با این وجود رقت انجام شده در این تحقیق به نسبت 1 به 1 شاید تخمین مناسبی نبوده است. از طرف دیگر موقعی كه میدان قوی تر یا پالس

طولانی تر شود تحریك پذیری اسپرم كاهش می یابد. عین همین مسئله در زمینه الكتروپورشن روی كشت های سلولی گزارش شده است. همچنین قدرت یونی بافر هم روی توانایی زیست اسپرم مؤثر است. در این تحقیق اختلاف معنی داری بین میزان بافی ماندگی تخم هایی كه تحت اثر میدان الكتریكی و پالس های مختلف قرار گرفته بودند با تخم هایی كه تحت سیستم بافری بدون پالس قرار داده شدند مشاهده نشده است. بلكه از نظر باقی ماندگی مشابه بوده اند. همچنین رشد جنینی در تخم هایی كه تحت تمیار بافری قرار داده نشدند با تخم هایی كه تحت تمیار بافری قرار گرفته بودند و تخم هایی كه تحت الكتروپورشن بوند یكسان بوده است. اختلافی كه در نتایج الكتروپورشن با اسپرم گون های مختلف است. كارایی میزان ورود پلاسمید به سلول گیرنده در الكتروپورشن به نوع سلول پارامترهای مختلف دیگری بستگی دارد.

سین و همكاران گزارش كردند كه ، در خصوص ورود یا عدم ورود DNA پلاسمید به میزبان اطلاعی ندارند اگر چه باندی از DNA پلاسمید با DNA میزبان را مشاهده كرند. ولی در عین حال باندهایی از DNA با وزن ملوكولی كم را هم مشاهده كردند. نظیر این پدیده روی ماهی لوچن توسط كوزلو (Kozlov) در سال 1989 گزارش شده است. علاوه بر این در ماهی قزل آلای 6 تا 12 ماه پلاسمید خارج كروموزومی گزارش شده است. اگر چه كهو در سال 1992 از پلاسمید خطی و حلقوی استفاده كرد و گزارش كرد كه هر دوی اینها خارج كروزومی هستند جانگ (Chong) در سال 1989 DNA پلاسمیدهای خطی و سوپر كویل را به تخم های لقاح یافته مدوكا تزریق كرد و مشاهده

كرد كه DNA پلاسمید خطی پس از 5 دقیقه به صورت به هم پیوسته می شود. از طرف دیگر زمانی كه DNA سوپر كویل را تزریق كرد مشاهده كرد DNA پلاسمیدی در سه فرم سوپر كویل و حلقوی با یك شكست و واحدهای متعدد حلقوی وجود دارد.

برای دریافت اینجا کلیک کنید