مقاله تعیین فعالیت سلولازی آکتینومیست های گرمادوست موجود در کمپوست قارچ خوراکی به روش ارزیابی با کاغذ صافی با word

توضیحات

 مقاله تعیین فعالیت سلولازی آکتینومیست های گرمادوست موجود در کمپوست قارچ خوراکی به روش ارزیابی با کاغذ صافی با word دارای 12 صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد مقاله تعیین فعالیت سلولازی آکتینومیست های گرمادوست موجود در کمپوست قارچ خوراکی به روش ارزیابی با کاغذ صافی با word  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله تعیین فعالیت سلولازی آکتینومیست های گرمادوست موجود در کمپوست قارچ خوراکی به روش ارزیابی با کاغذ صافی با word،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد

بخشی از متن مقاله تعیین فعالیت سلولازی آکتینومیست های گرمادوست موجود در کمپوست قارچ خوراکی به روش ارزیابی با کاغذ صافی با word :

مقدمه

از گذشتههای دور قارچها دارای ارزش دارویی و خوراکی برای بشر بودهاند. با عمومیت یافتن کشت و پرورش قارچ تولید جهانی آن افزایش یافته است. تولید قارچ میتواند مقادیر عظیمی از مواد زائد لیگنوسلولزی را به طیف گستردهای از محصولات (دارویی، خوراکی و کود) تبدیل کند و همچنین از محیط زیست محافظت نماید .(1) قارچ خوراکی دکمهای سفید با سایر قارچهای خوراکی مورد کشت، از نظر تغذیهای و درمانی تفاوت چندانی ندارد، اما آنچه که این قارچ را کاملاً متمایز از سایر قارچها ساخته است، گسترش جهانی تولید این قارچ است، به طوری که این قارچ در تمامی سوپرمارکتهای جهان فروش زیادی

26

دارد .(5) افزایش عملکرد قارچ خوراکی دکمهای سفید وابستگی مستقیم با کیفیت کمپوست دارد. برای پژوهشگرانی که راجعبه کمپوست تحقیق میکنند تعیین تنوع و ساختار جمعیت میکروبی درگیر در فرآیند کمپوستسازی بسیار مهم است. جمعیت میکروبی کمپوست نقش اساسی در تولید کمپوست با کیفیت مطلوب دارد .(17)

آکتینومیستها به ویژه گونههای گرمادوست مهم ترین اجزای جمعیت میکروبی کمپوست هستند که به عنوان تجزیهکننده مواد سلولزی از نظر کشاورزی، بسیار حائز

L-Tyrosine

K2HPO4
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393

اهمیت میباشند. این باکتریها منابع مهم تولید آنتیبیوتیکها به شمار میروند(.(4

آکتینومیستهای گرمادوست هوازی و غیر اسید فست هستند. این موجودات گرم مثبت و دارای فیلامنتهای شاخهدار بوده و در دیواره سلولی آنها میکولیک اسید وجود ندارد .(10) این گروه بیشتر بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی از جمله تولید میسلیوم هوایی و رویشی طبقهبندی شدهاند. جنسهای مختلفی در این گروه از آکتینومیستها وجود دارند .(21)

جنس Streptomyces یکی از مهم ترین آکتینومیستهای گرمادوست است. گونههای این جنس توانایی تجزیه بسیاری از ماکرومولکولهای مختلف مانند ترکیبات سلولزی، نشاسته، لیپید و کیتین را دارا میباشند. نژادهای متفاوتی از آنها برای توانایی تجزیه سلولز مورد مطالعه قرار گرفتهاند. نژادهای Streptomyces مقادیر زیادی پروتئینهای خارجسلولی از جمله سلولاز ترشح میکنند .(13)

سلولازها کمپلکسی آنزیمی از سه گروه می باشند که بطور همافزایی با یکدیگر عمل میکنند و میتوانند پیوندهای گلوکوزیدی (1- 4) را هیدرولیز نمایند. این آنزیم از بتا

1و-4 اندوگلوکاناز، سلوبیوهیدرولاز و بتا گلوکوزیداز تشکیل شده است .(20)
در مطالعه ای که توسط جانگ و چن در سال 2003 انجام شد، جدایهای از جنس Streptomyces با توانایی تولید سلولاز مقاوم به حرارت معرفی شد .(13) محققان دیگری نیز گونههای S. lividens ، S.albaduncus ،S.reticuli را گزارش کردهاند که در شرایط بهینه و استفاده از پودر سلولز به عنوان منبع کربن دارای تولید آنزیم اندوگلوکاناز قابل توجهی بودند .(6)

ترکیب جمعیت میکروبی کمپوست قارچ خوراکی در فاز دوم یکی از مهم ترین عوامل مؤثر در میزان عملکرد قارچ خوراکی است. شناسایی آکتینومیستهای دارای قدرت تجزیه سلولز میتواند جهت دستورزی ترکیب کمپوست

استفاده گردد و عملکرد قارچ در واحد سطح را افزایش دهد. هدف از این مطالعه بررسی تنوع این باکتریها و تعیین فعالیت سلولازی آنها به روش اندازه گیری سلولاز کل با سوبسترای کاغذ واتمن شماره 1 بود. این جدایهها برای تلقیح روی کمپوست قارچ خوراکی جهت بهبود کیفیت آن به کار برده شدند.

مواد و روشها

جداسازی باکتریها: نمونههای کمپوست مورد استفاده در این تحقیق، از مرکز تحقیقات قارچهای خوراکی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد تهیه شد. نمونهبرداری از مراحل مختلف فاز دوم کمپوستسازی انجام شد.
نمونهها توسط تکنیک رقیقسازی در محیط کشت کمپوست آگار غنی شده با محیط CYM (ترکیبات CYM

1 Peptone :(5X) گرم، 0/24 گرم،

0/5KH2PO4 گرم، 1 Yeast Extract گرم، 10 Dextrose

گرم و 0/5 MgSO47H2O گرم در 100 میلی لیتر آب مقطر) در دمای 40 درجه سانتی گراد تا ظاهر شدن کلنی باکتریها قرار داده شدند. کلنیهای با ظاهر گچی و خشبی به محیط جدید منتقل شده و کشتهای خالص از هر کدام از جدایهها تهیه شد.

آزمونهای بیوشیمیایی: آزمونهای احیاینیترات، کاتالاز، هیدرولیز اوره، اسیدفست جزئی و رنگ آمیزی گرم روی جدایهها انجام شد. باکتریها برای بررسی ظاهر کلنی و اندام هوایی روی محیط کشت آب-آگار کشت شدند. توانایی تولید ملانین با استفاده از محیط کشت ] ISP7ترکیبات

15 Glycerol :ISP7 گرم، 0/5 گرم، L-

1 Asparagine گر م، 0/5 K2HPO4 گرم، MgSO47H2O

0/01 گرم، 1 Trace Element HO -LE میلیلیتر (ترکیبات

2/85 H3 BO3 :Element HO-LE گرم، 1/8 MnCl24H2O

گرم، 1/77 Sodium Tartate گرم، 1/36 FeSO47H2O

گرم، 0/04 CoCl26H2O گرم، 0/027 CuCl22H2O گرم،

27

ZnCl2

Na2MoO42H2O
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393

0/025 گرم، 0/02 گرم در 1000

میلیلیتر آب مقطر) و 15 Agar گرم در 100 میلیلیتر آب

مقطر[ و تولید رنگیزه در هر کدام از جدایهها با استفاده از محیط کشت ] ISP5 ترکیبات 10 Glycerol :ISP5 گرم، L-

1 Asparagine گرم، 1 K2HPO4 گرم، Trace Salt 1 Soulation میلیلیتر (ترکیبات : Trace Salt Soulation

1 FeSO47H2O گرم، 1/0 MnCl24H2O گرم و

0/1 ZnSO47H2O گرم در 100 میلیلیتر آب مقطر) و 15 Agar گرم در 1000 میلیلیتر[ مورد بررسی قرار گرفت .(18)

شناسایی مولکولی: پس از استخراج DNA از جدایههای آکتینومیست، با استفاده از پرایمرهای عمومی ژن

16SrRNA، fD1 (توالی پرایمر رفت 5′- :fD1

(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ و rP2 (توالی

پرایمر برگشت 5′- :rP2

(22) (ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′ واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام گردید. چرخه حرارتی PCR به صورت مرحله دناتوراسیون اولیه در دمای 96 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه، دناتوراسیون در دمای 96 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه در بقیه چرخهها، مرحله اتصال در دمای 56 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله طویلشدن در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت

2 دقیقه انجام گرفت. مرحله آخر طویل شدن به مدت 5

دقیقه انجام شد. این برنامه در 30 چرخه تکرار گردید. به منظور شناسایی و تعیین تنوع جدایههای آکتینومیستها، الگوی برشی ژن 16SrRNA برای هر کدام از جدایهها پس از هضم با آنزیمهای MboI ,KpnI ,PstI ,HindIII ,SalI

از این نتایج آکتینومیستهای جداسازی شده شناسایی

شدند.

اندازهگیری فعالیت آنزیمی: از محیط کشت تولید آنزیم

سلولاز با ترکیب 1 CMC(Carboxymethylcellulose))

درصد، 0/5 Yeast extract درصد، 0/05 K2HPO4درصد، 0/02 NaClدرصد ،0/02 MgSO47H2Oدرصد، NH4NO3
0/1درصد و 0/002 FeCl3درصد) برای تعیین فعالیت آنزیمی جدایهها استفاده شد. باکتریها در دمای 40 درجه سانتی گراد به مدت 72 ساعت در این محیط کشت قرار داده شدند. در تراکم نوری یکسان (OD600nm=1)، محیط کشتها پس از عبور از کاغذ صافی، در 6000 rpm به مدت

15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. عصاره حاصل پس از عبور از فیلتر میلی پور 0/22) میکرومتر) به عنوان منبع آنزیم استفاده گردید. مقدار پروتئین در عصاره آنزیمی ناخالص با روش برادفورد اندازهگیری شد .(7) از عصارههای آنزیمی به دست آمده از رشد هر جدایه برای توانایی هیدرولیز سوبسترای، فیلتر کاغذی 1×6 سانتیمتری (واتمن شماره
(1 مورد استفاده قرار گرفت. مخلوط سوبسترا با یک میلیلیتر عصاره آنزیمی و یک میلیلیتر بافر فسفات 6/5-9

pH : به مدت 30، 60 و 90 دقیقه در حمام آب گرم با دماهای 45 تا 65 درجه سانتی گراد نگهداری شد. مقدار قند احیاء کننده آزاد شده با استفاده از روش

(16) DNS (Dinitrosalicylic acid) اندازهگیری شد.

فعالیتهای آنزیمی به صورت واحد در میلیلیتر عصاره ناخالص آنزیمی گزارش شد .(11)

بحث و نتیجه گیری

,PaeI ,VspI با استفاده از نرم افزار TotalLabTL120 تهیه شد. الگوهای برشی به دست آمده برای هر جدایه با الگوهای به دست آمده از هضم توالیهای معتبر آکتینومیستهای ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی NCBI که در محیط اینسیلیکو هضم شده بود مقایسه شد. با استفاده

28

نتایج حاصل از آزمونهای بیوشیمیایی باکتریهای آکتینومیست جدا شده در جدول 1 آورده شده است. این نتایج منطبق بر خصوصیات آکتینومیستها بود.

نتایج تجزیه و تحلیل مولکولی: براساس نتایج به دست آمده از هضم اینسیلیکوی توالیهای ژن 16SrRNA با

مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393

استفاده از آنزیمهای برشی، آنزیم MboI به عنوان آنزیم از این آنزیم (شکل (1 جدایهها را میتوان به سه گروه
کلیدی در شناسایی آکتینومیستهای جداسازی شده متمایز دستهبندی کرد (جدول .(2
انتخاب شد .(9) با استفاده از الگوی برشی به دست آمده

جدول-1 مشخصات جدایهها همراه با نتایج تستهای بیوشیمیایی آنها
شماره محل رنگ اسپور آزمون آزمون آزمون آزمون آزمون ISP5 ISP7
جدایهها جمعآوری گرم اسیدفست کاتالاز اورهآز احیای
(کمپوست) نیترات
1 فاز 2 سفید + – + + + + +
2 فاز 2 سفید + – + – + + +
3 فاز 2 سفید + – + + + + +
4 فاز 2 خاکستری + – + – + + +
5 فاز 2 سفید + – – + + + +
6 فاز 2 سفید + – + + + + +
7 فاز 2 خاکستری + + + + – + –
8 فاز 2 سفید + – + + + + +
9 فاز 2 سفید + – + + + + +
10 فاز 2 سفید + + + – + + +
11 فاز 2 خاکستری + – + + + + +
12 فاز 2 سفید + -+ + – + + –
13 فاز 2 سفید + + + + + + –
14 فاز 2 خاکستری + – + + + + +
15 فاز 2 سفید + + + + – + –
16 فاز 2 سفید + – + + – + +
17 فاز 2 خاکستری + – + + + + –
18 فاز 2 سفید + – + + – – +
19 فاز 2 سفید + – + + + + –
20 فاز 2 سفید + – + + + + +
21 فاز 2 خاکستری + – + + – + –
22 فاز 2 سفید + + + – + + +
23 فاز 2 سفید + – + – + + +
24 فاز 2 زرد + + + – + + +

جدول-2 تقسیمبندی باکتریها به سه گروه اصلی براساس الگوی برشی آنزیم .MboI

شماره جدایه الگوی برشی با آنزیم MboI
23،22،21،20،19،17،16،15،14،13،12،11،10،9،8،7،6،5،4،3،2،1 بزرگترین قطعه 750> DNA جفت باز (گروه (1
24 دو قطعه مشخص که با هم 980> جفت باز (گروه (2

29

مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
18 بزرگترین قطعه DNA برابر با 980 تا 1350 جفت باز
(گروه (3

شکل-1 الگوی برشی جدایهها بر اساس ژن 16SrRNA، توسط آنزیم برشی MboI

اشتراک‌گذاری:

• Click to share on Facebook (در پنجر تازه باز می‌شود)

• برای به اشتراک گذاشتن روی لینکداین کلیک کنید (در پنجر تازه باز می‌شود)

• Click to share on Telegram (در پنجر تازه باز می‌شود)

• کلیک کنید تا روی گوگل+ به اشتراک گذاشته شود (در پنجر تازه باز می‌شود)

برای دریافت اینجا کلیک کنید