مقاله خالص سازی و شناسایی نسبی پیگمان کاروتنوئیدی Haloarcula sp. IRU1 آرکی بسیار نمک دوست جدا شده از دریاچه نمک ارومیه در word

توضیحات

 مقاله خالص سازی و شناسایی نسبی پیگمان کاروتنوئیدی Haloarcula sp. IRU1 آرکی بسیار نمک دوست جدا شده از دریاچه نمک ارومیه در word دارای 17 صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد مقاله خالص سازی و شناسایی نسبی پیگمان کاروتنوئیدی Haloarcula sp. IRU1 آرکی بسیار نمک دوست جدا شده از دریاچه نمک ارومیه در word  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله خالص سازی و شناسایی نسبی پیگمان کاروتنوئیدی Haloarcula sp. IRU1 آرکی بسیار نمک دوست جدا شده از دریاچه نمک ارومیه در word،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد

بخشی از متن مقاله خالص سازی و شناسایی نسبی پیگمان کاروتنوئیدی Haloarcula sp. IRU1 آرکی بسیار نمک دوست جدا شده از دریاچه نمک ارومیه در word :

مقدمه

کاروتنوئیدها رنگیزه های ایزوپرونوئیدی محلول در چربی میباشند و در طبیعت به وفور یافت میشوند. این ترکیبات عامل رنگهای سبز، زرد، قرمز و نارنجی در برگهای گیاهان، میوهها، گلها و حیوانات مانند پرندگان، حشرات، ماهیها وسختپوستان می باشند .(5) کاروتنوئیدها رنگدانههایی هستند که معمولاً در گیاهان، جلبکها و باکتریهای فتوسنتتیک، به دلیل نقش حیاتی آنها در فرآیندهای فتوسنتزی یافت میشوند. همچنین این رنگدانه-

ها در بعضی از باکتریهای غیر فتوسنتزی، مخمرها و کپکها نیز به عنوان آنتی اکسیدانت و پایدارکننده غشاهای سلولی و به منظور حفاظت در برابر آسیبهای ناشی از نور و اکسیژن تولید می شوند .(8) حیوانات قادر به تولید این رنگدانهها نیستند و آنها را از رژیم غذایی دریافت میکنند.

کاروتنوئیدها در حیوانات باعث رنگی شدن آنها شده و در بدن آنها بعنوان آنتی اکسیدانهای بیولوژیک و پیش ساز ویتامین A فعالیت میکنند (9) و علاوه بر دفاع درونی بدن در مقابل استرسهای اکسیداتیو، در حفاظت بدن در مقابل بیماریها و پدیده پیری نیز نقش دارند 2) و .(17

تاکنون 700 کاروتنوئید مختلف شناسایی شده است (7) و

در حال حاضر این رنگیزه ها به عنوان مواد افزودنی مجازغذایی اهمیت ویژه ای پیدا کرده اند .(15) بیوسنتز کاروتنوئیدها در میکروارگانیسم ها نیز مورد مطالعه قرار گرفته است .(6) در این پژوهش کاروتنوئیدهای تولید شده توسط سویه Haloarcula sp. IRU1 بررسی گردیده است.

این سویه متعلق به آرکیهای بسیار نمک دوست است و از آب دریاچه ارومیه جداسازی و شناسایی شده است .(1)
کلونیهای این آرکی به دلیل حضور پیگمان کاروتنوئیدی قرمز و نارنجی هستند. معمولاً پیگمانتاسیون آرکیهای نمک دوست منجر به تولید کاروتنوئیدهای قرمز- نارنجی رنگ، غالباً با ساختار 50 کربنه با نام باکتریوروبرین می گردد 10)

و .(11 در این مطالعه، ابتدا رنگدانههای کاروتنوئیدی

میکروارگانیسم مورد نظر به ویژه فراوانترین کاروتنوئید موجود در آن تخلیص و تا حد امکان شناسایی گردید.

سپس به منظور تعیین ساختار پیگمان کاروتنوئیدی اصلی این سویه از روشهای اسپکتروفتومتریUV ، TLC ، NMR

واسپکتروفتومتری جرمی استفاده گردید.

مواد و روشها

آرکی و محیط کشت: در مطالعه قبلی سویه مورد بررسی از آب دریاچه ارومیه جداسازی شده و با روشهای
استاندارد میکروبیولوژیکی، بیوشیمیایی و توالی یابی

مورد شناسایی قرار گرفته و در بانک ژنی

NCBIبا شماره HM625751.1 به ثبت رسیده است. این

جدایه به صورت لیوفیلیزه در آزمایشگاه ملی

میکروبیولوژی صنعتی دانشگاه الزهرا(س) نگهداری

می شود. طبق آزمایشات صورت گرفته توسط شیرزاد بهینه سازی شرایط رشد این آرکی اکستریموفیل انجام شده است. بنابراین در این تحقیق، محیط کشت مناسب و با

شرایط بهینه به دست آمده برای رشد

IRU1 مورد استفاده قرار گرفت .(1) برای تهیه یک لیتر محیط کشت از این مواد بر حسب گرم استفاده شد: 250 NaCl، MgCl2.6H2O 34/6، MgSO4.7H2O 49/4،
Yeast extract 5 ،CaCl2 .2H2O 0/92، NaBr0 /58،

KCl0/5، .NaHCO3 0/17 همه مواد از شرکت Merck تهیه شده است.

برای تهیه این محیط کشت، نمکهای اصلی محیط کشت شامل NaCl ،MgCl2.6H2O وMgSO4.7H2O، در یک ارلن

و سایر مواد محیط کشت که شامل نمکهای با درصد پایین

و عصاره مخمر میباشند، در یک ارلن دیگر، به طور مجزا، پس از اضافه کردن نیمی از آب مورد نیاز و تنظیم pH
محیط بین 6/8 – 7 و رساندن به حجم نهایی، در دمای

120 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شده و

327

vacuum evaporator
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392

سپس بلافاصله در شرایط استریل با هم مخلوط شدند. پس از تلقیح میکروارگانیسم، محیط کشت تهیه شده به نسبت یک به ده در چند ارلن مایر تقسیم شده و به مدت چهار روز در انکوباتور شیکردار با شرایط دمای 47 درجه سانتی گراد و 200 دور در دقیقه قرار داده شد. پس از این مدت، محیط کشت حاوی باکتری، ابتدا در لولههای فالکون، به مدت 20 دقیقه و با 11000 × g سانتریفیوژ شد و پس از دور ریختن مایع رویی، رسوب حاصله توسط آب نمک

15 درصد به صورت سوسپانسیون درآمد و مجدداً سانتریفیوژ گردید. سپس بیومس باکتریایی جمع آوری و در فریزر -20 درجه سانتی گراد نگهداری شد.
تعیین بیومس آرکی: محیط کشت این سویه حاوی مقادیر زیادی نمک می باشد، بنابراین برای تعیین وزن بیومس خالص آرکی، نیاز به برآورد میزان رسوب نمکی می باشد که احتمالاً در هنگام سانتریفیوژ کردن همزمان با بیومس حقیقی رسوب می کند. بدین منظور حدود 100 میلی لیتر محیط کشت حاوی آرکی و 100 میلی لیتر محیط کشت فاقد آرکی که دارای تمام شرایط محیط کشت حاوی آرکی بود، در لوله های فالکونی که از قبل وزن آنها اندازه گیری شده بود سانتریفیوژ شدند. پس از خارج کردن محلول رویی، مجدداً فالکونها توزین شده و با کم کردن وزن رسوب نمک به دست آمده در فالکون حاوی محیط کشت فاقد باکتری از وزن به دست آمده از رسوب حاصله از فالکون حاوی محیط کشت واجد آرکی، وزن دقیق بیومس آرکی محاسبه گردید. برای تعیین وزن خشک آرکی فالکون حاوی بیومس به مدت 72 ساعت در آون 70 درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از این مدت، وزن رسوب خشک به دست آمده، اندازه گیری گردید.

شکستن دیواره سلول و استخراج عصاره کاروتنوئیدی:

میزان مشخصی از بیومس آرکی درون یک لوله شیشه ای سرپوش دار ریخته شد و تقریباً به اندازه سه برابر وزن بیومس، به آن پودر شیشه نرم اضافه گردید. پس از افزودن

استون به بیومس و پودر شیشه، به مدت پنج دقیقه ورتکس شد. سپس لایه رویی جمع آوری و مجدداً به رسوب باقیمانده استون اضافه گردید و عمل ورتکس کردن تکرار شد تا بیومس به طور کامل بی رنگ گردد. پس از انتقال کامل پیگمانها به استون، محلول حاصل به مدت ده دقیقه و با 11000 × g سانتریفیوژ شد تا ذرات پودر شیشه و باقی مانده سلولهای باکتری متلاشی شده از محیط خارج شوند.
سپس به حجم محلول استون جمع آوری شده، هگزان اضافه گردید و به منظور جدا کردن دو فاز از یکدیگر، شستشو توسط آب مقطر انجام شد. این کار چندین بار تکرار گردید تا استون به طور کامل از هگزان جدا شده و تمامی پیگمانها به لایه هگزان منتقل شدند. به لایه رویی جمع آوری شده نمک سولفات سدیم بدون آب اضافه شد تا آب باقی مانده در محیط به طور کامل گرفته شود. برای تأیید روش انجام شده برای استخراج پیگمانها، این مراحل در شرایط مشابه سه بار تکرار گردید و هر بار بلافاصله جذب محلول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج 490 نانومتر خوانده شد.

اندازه گیری مقدار کل کاروتنوئیدها: برای تعیین میزان کل کاروتنوئیدهای استخراج شده مراحل کار تا مرحله استخراج در هگزان انجام شده و حجم هگزان یادداشت گردید. سپس با اسپکتروفتومتر جذب آن را در طول موج
490 نانومتر خوانده و با توجه به فرمول زیر غلظت کاروتنوئیدها بر حسب میکروگرم در هر گرم وزن خشک باکتری محاسبه گردید:

Total carotenoid (g/g of biomass) = (ml of acetone) × (A490) ×10000 / 2500 × (biomass dry weight)
پس از استخراج کاروتنوئیدها در هگزان، محلول حاصل

توسط دستگاه به طور کامل تغلیظ

گردید. سپس عصاره باقی مانده در حجمی از استون که به اندازه حجم هگزان به کار رفته بود، حل شد. طیف جذب نوری محلول حاوی عصاره کاروتنوئیدی به دست آمده در

328

UV-Visible ، FT-IR ،
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392

هگزان، در ناحیه طول موجهای 300 – 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت شد و نقاط جذب ماکزیمم آن به دست آمد.
جداسازی و شناسایی پیگمانها: پس از تهیه عصاره کاروتنوئیدی، به منظور جداسازی و شناسایی پیگمانها روش کروماتوگرافی با لایه نازك (TLC) با استفاده از تعدادی مارکر استاندارد کاروتنوئیدی شامل بتاکاروتن، آستاگزانتین، کانتاگزانتین و زئاگزانتین به کاربرده شد. برای تهیه صفحات TLC از پلیتهای شیشهای و پودر سیلیکاژل
60F254 مرك استفاده شد. پلیتها با ضخامت 300 میکرون و توسط دستگاه مخصوص تهیه گردید. سپس برای فعال سازی صفحات TLC، پلیت های تهیه شده به مدت یک ساعت در آون با دمای 100 درجه سانتی گراد قرارداده شدند. به منظور انجام کروماتوگرافی، ابتدا محلول کاروتنوئیدی توسط vacuum evaporator به طور کامل تغلیظ شد و عصاره روغنی باقی مانده در مقدار بسیار کمی استون حل گردید. سپس مقداری از نمونه توسط لوله مویین برداشته شده و به فاصله یک سانتیمتری از انتهای پلیت بر روی صفحه TLC قرار داده شد و بلافاصله درون تانک کروماتوگرافی که دارای حجمی از حلالهای استون و پترولئوم اتر به ترتیب با نسبت 65 : 35 بود، به مدت تقریباً 45 دقیقه قرار داده شد. لازم به ذکر است که برای انجام کروماتوگرافی حلالهای مختلف با نسبتهای متفاوت مورد استفاده قرار گرفت. این حلالها شامل اتیل استات- بنزن، استون – بنزن، متانول- کلرفرم و استون-

پترولئوم اتر بود، که در این میان، بهترین الگوی جداسازی مشاهده شده، با استفاده از استون و پترولئوم اتر و به ترتیب با نسبت 65 : 35 به دست آمد. پس از این که حلال به انتهای صفحه TLC رسید و لکه ها به طور کامل از یکدیگر تفکیک شدند، پلیت از تانک کروماتوگرافی خارج و بلافاصله RF تمامی لکه ها محاسبه گردید. در مراحل بعدی و به منظور مقایسه مارکرهای موجود با لکه های مشاهده شده، هر یک از استانداردهای بتاکاروتن،

آستاگزانتین، کانتاگزانتین و زئاگزانتین، به طور جداگانه و همزمان با نمونه حاوی عصاره کاروتنوئیدی بر روی صفحات TLC قرار داده و با همان نسبت حلالها کروماتوگرافی شدند.
تخلیص کاروتنوئید اصلی با استفاده از روش :TLC پس

از انجام کروماتوگرافی و جداسازی پیگمانها و آشکار شدن باندهای متعدد ، به منظور انجام آنالیزهای بیشتر و تا حد امکان شناسایی دقیق تر، قوی ترین و بزرگترین باند مشاهده شده، از روی صفحه TLC برداشته شد. بدین منظور بلافاصله پس از خارج کردن پلیت از تانک کروماتوگرافی، ناحیه باند مورد نظر از روی صفحه TLC

جمع آوری شد و فوراً درون ویالهای حاوی استون ریخته شد. در ادامه، ویالها ورتکس شده و سپس در دستگاه میکروفیوژ به مدت پنج دقیقه و با 15000 × g سانتریفیوژ گردیدند. بلافاصله پس از خارج کردن ویالها، محلول رویی توسط پیپت پاستور از روی رسوب پودر سیلیکاژل برداشته شد و به ظرف دیگری منتقل گردید.

اندازهگیری مقدار کاروتنوئید اصلی: پس از تخلیص و جمع آوری محلول استون حاوی کاروتنوئید اصلی، محلول حاصل کاملاً تغلیظ شد. سپس عصاره باقی مانده، مجدداً در حجمی از استون که به اندازه حجم هگزان به کار رفته در مرحله استخراج کل پیگمانها برای میزان مشخصی بیومس بود، حل گردید و جذب آن در طول موج 490
نانومتر خوانده شد. سپس مقدار تقریبی این کاروتنوئید بر حسب میکروگرم در هر گرم وزن خشک باکتری محاسبه گردید.
آنالیز و شناسایی کاروتنوئید اصلی: برای آنالیز پیگمان کاروتنوئیدی تخلیص شده با روش کروماتوگرافی با لایه

نازك، از روشهای طیف سنجی

MS و NMR استفاده شد.

329

مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392

طیف سنجی :UV-Visible در این مطالعه، با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر، نقاط ماکزیمم جذب کاروتنوئید اصلی در ناحیه طول موجهای 300 – 600 نانومتر اسکن شده و با طیف حاصل و نقاط ماکزیمم جذب به دست آمده از کاروتنوئید باکتریوروبرین و مشتقات نزدیک آن در حلال استون، در منابع موجود مقایسه گردید 10) و .(18

طیف سنجی :FT-IR برای گرفتن طیف پیگمان خالص سازی شده، از عصاره خشک به دست آمده دیسک KBr

تهیه شد و طیف حاصل با طیف مربوط به کاروتنوئید باکتریوروبرین و مشتقات نزدیک آن در منابع موجود مقایسه گردید 10) و .(18

طیف سنجی جرمی: در این تحقیق، اسپکترومتری جرمی (EI MS) برای تعیین وزن مولکولی پیگمان کاروتنوئیدی مورد نظر مورد استفاده قرار گرفت.
طیف سنجی :NMR برای گرفتن طیف H-NMR، عصاره کاروتنوئید مورد نظر کاملاً خشک شده و با حلال کلروفرم دوتره در دستگاه 500 NMR مگاهرتز، طیف آن رسم گردید.

نتایج

آرکی مورد مطالعه یک میکروارگانیسم هوازی میباشد. در صورت تهیه محیط کشت آن در حجم یک به ده در ارلن مایر، باکتری از سرعت رشد بالاتری برخوردار بوده و در زمان کمتری به حداکثر رشد خود میرسد، که این زمان چهار روز میباشد. در طی این مدت رنگ محیط کشت کدر شده و به رنگ قرمز – نارنجی تغییر پیدا میکند. پس از سانتریفیوژ کردن محیط کشت حاوی باکتری و جمع آوری بیومس به دست آمده، میزان بیومس 8/2 گرم در لیتر محاسبه شد. وزن خشک بیومس حاصل نیز، پس از قرار دادن در آون 70 درجه سانتی گراد و به مدت 72
ساعت، 0/17گرم در هر گرم از بیومس تر محاسبه شد.

اولین مرحله برای استخراج پیگمانهای کاروتنوئیدی، شکستن دیواره سلولی میکروارگانیسم میباشد. این آرکی اکستریموفیل که توانایی زیستن در غلظت بالای نمک را دارد، حداکثر تا نیم ساعت قادر به تحمل فشار اسمزی پایین آب مقطر میباشد و بیشتر سلولها بلافاصله متلاشی میشوند. البته در روند استخراج کاروتنوئیدها از این باکتری، استفاده از آب مقطر و سپس اضافه کردن حلال، شرایط چندان مطلوبی ایجاد نمیکرد و ترجیحاً از این کار صرفنظر شد. در این تحقیق، ابتدا سعی بر این بود که شکستن سلول و استخراج پیگمانها توسط متانول صورت گیرد. متانول به تنهایی حلال بسیار خوبی برای استخراج پیگمانهای کاروتنوئیدی از این باکتریها محسوب میشود

.(4) البته این مشکل وجود داشت که در مرحله بعد با اضافه کردن حلال هگزان و شستشو با آب مقطر، مقدار قابل توجهی از کاروتنوئیدها تمایل زیادی به متانول از خود نشان میدادند و انتقال آنها از متانول به هگزان به خوبی اتفاق نمی افتاد. البته در صورت انجام تکانهای شدید، در نهایت لایه متانول به طور کامل بیرنگ میشد، ولی مقداری از پیگمانها به شکل ذرات تودهای شکل قرمز رنگ از محیط خارج شده و بین دو لایه قرار میگرفتند.

اشتراک‌گذاری:

• Click to share on Facebook (در پنجر تازه باز می‌شود)

• برای به اشتراک گذاشتن روی لینکداین کلیک کنید (در پنجر تازه باز می‌شود)

• Click to share on Telegram (در پنجر تازه باز می‌شود)

• کلیک کنید تا روی گوگل+ به اشتراک گذاشته شود (در پنجر تازه باز می‌شود)

برای دریافت اینجا کلیک کنید