دانلود بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت گونه Anemone narcissiflora از تیره Ranunculaceae با استفاده از نشانگرهای مولکولیPCR - RAPD تحت word

فهرست مطالب   

چکیده    2
پیش گفتار    3
فصل اول : کلیات وبررسی منابع   
1-1 کلیاتی در مورد گیاه مورد مطالعه    5
1-1-1  رده بندی گیاه    5
1-1-2  گیاه شناسی راسته آلاله       Ranunculales        6
1-1-3  گیاه شناسی تیره آلاله       Ranunculacea    6
1-1-4  گیاه شناسی جنس       Anemone    7
1-1-5  گیاه شناسی گونه      Anemone narcissiflora      9
1-1-6  کلید شناسایی زیر گونه ها    narcissiflora و willdenowii    10
1-1-7  اهمیت تیره آلاله    10
1-1-8  ترکبیات شیمیایی گیاهان تیره آلاله    12
1-2  مروری بر روش های نشانگر مولکولی در گیاهان    12
1-2-1  مارکرهای مولکولی    13
1-2-2 کاربردهای مارکر های DNA    19
1-3  واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR    21
1-3-1  مراحل PCR    23
1-3-2  کاربرد های PCR    23
1-4 تکنیک RAPD    24
1-4-1  اصل علمی تکنیک RAPD    25
1-4-2  کاربرد آنالیز های RAPD    26
1-4-3  الحاق نشانگر های ژنتیکی توسعه یافته به یک خصوصیت مورد مطالعه    26
1-4-4  جمعیت و توارث ژنتیکی    27
1-4-5 تکرار پذیری نشانگر های RAPD     28
1-4-6  مشاهدات پایانی    28

فصل دوم   
مواد و روش ها   
1-2 جمع آوری نمونه ها و آماده سازی آنها    31
2-2 استخراج DNA ژنومی از نمونه مورد مطالعه    34
2-2-1  محلول ها و بافر های لازم برای استخراج DNA    34
2-2-1-1  بافر استخراج    34
2-2-1-2  محلول CTAB / NACL    35
2-2-1-3  بافر  CTAB Percipitation    35
2-2-1-4  بافر High Salt TE     36
2-2-1-5  کلروفورم – ایزوآمیل الکل (24:1)    36
2-2-2  مراحل استخراج DNA  ژنومی از نمونه های گیاهی    36
2-3  بررسی کمیت و کیفیت DNA ژنومی استخراج شده    39
2-3-1 روش الکتروفورز    39
2-3-2 روش اسپکتروفتومتری    39
2-4  محلول ها و بافر های لازم برای الکتروفورز ژل آگارز    41
2-4-1 محلول بافر TBE (10X)    41
2-4-2 محلول بافر TBE (1X)    41
2-4-3 ژل آگارز    41
2-4-4 /DNA Sample Buffer     DNA Loading    42
2-5  الکتروفورز ژل آگارز    42
2-6 واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) با آغازگرهای RAPD    43
2-6-1 مواد و وسایل لازم برای انجام PCR-RAPD    43
2-6-1-1 DFS Master MIX      43
2-6-1-2 آغازگرها    44
2-6-1-3  آب دیونیزه    44
2-6-1-4  DNA الگو    44
2-6-2 واکنش PCR-RAPD    45
2-6-1-2  آماده سازی واکنشگر PCR-RAPD    45
2-6-2-2  چرخه حرارتی   PCR  45
2-7 تهیه ژل آگارز و الکتروفورز فرآورده های تکثیر شده    46
2-8  عکس برداری نمونه ها    48
2-9 تجزیه داده های  RAPD    48
2-10 محاسبه فواصل ژنتیکی بر اساس داده های RAPD    49
   

فصل سوم   
نتایج   
3-1  کیفیت و کمیت DNA ژنومی استخراج شده    51
3-2  شرایط بهینه PCR –RAPD     52
3-2-1  غلظت واکنش گرهای PCR –RAPD    52
3-2-1-1  DNA ژنومی    52
3-2-1-2  پرایمرها     52
3-2-2  برنامه دمایی و زمانی بهینه جهت انجام PCR    53
3-3  الگوی باندی حاصل از PCR –RAPD    55
3-4  داده های حاصل از PCR –RAPD    55

فصل چهارم   
4-1 نتیجه گیری کلی و بحث    72
پیشنهادات    74
   
فهرست شکل ها   
شکل1-1  نقشه مکان اصلی گیاه مورد استفاده در این تحقیق    29
شکل 2-1  گل آذین های 1 تا 7 تایی    32
شکل 2-2  نمایی از پودر کردن مواد گیاهی    33
شکل 2-3  دستگاه نانودراپ برای تعیین کمیت DNA    40
شکل2-4  دستگاه ترموسایکلر    46
شکل 2-5  دستگاه الکتروفورز افقی    47
شکل 2-6  دستگاه ژل داک    48
شکل 3-1 الگوی باندی DNA ژنومی استخراج شده روی ژل 1 %    51
شکل 3-2  نمونه الگوی باندی حاصل از الکتروفورز محصول PCR-RAPD توسط پرایمرRP6     55
شکل3-3  دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمر RP1    57
شکل3-4   دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP2    59
شکل3-5  دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP3    61
شکل 3-6 دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP4    63
شکل 3-7 دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP6               65
شکل3-8  دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP7         67
شکل3 -9  دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS کل پرایمر    70
   
فهرست جدول ها   
جدول 2-1  مواد لازم برای تهیه بافر استخراج DNA ژنومی    34
جدول 2-2  مواد لازم برای تهیه بافر CTAB Percipitation    35
جدول 2-3  مواد لازم برای تهیه بافرHigh Salt TE    36
جدول 2-4  مواد لازم برای تهیه/ DNA Sample Buffer     DNA Loading    42
جدول 2-5  نام وتوالی آغازگرهای RAPD    44
جدول 2-6  چرخه حرارتیPCR       45
جدول 3-1  نتایج نانودراپ    51
جدول 3-2  غلظت واکنش گرهای مربوط به پرایمر ها     52
جدول 3-3  دمای اتصال ودرصد GC مربوط به پرایمرها    53
جدول 3-4  برنامه، دما وزمان لازم جهت انجام PCR برای پرایمر هایRP1 ، RP2، RP3، RP4،RP6 ، RP7    54
جدول 3-5  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP1    56
جدول 3-6  ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD توسط پرایمرRP1    56
جدول 3-7 کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP2    58
جدول 3-8  ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD توسط پرایمرRP2    58
جدول 3-9  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP3    60
جدول 3-10 ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط پرایمرRP3      60
جدول 3-11  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP4    62
جدول 3-12 ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط پرایمرRP4      62
جدول 3-13 کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP6    64
جدول 3-14 ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط پرایمرRP6      64
جدول 3-15  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP7    66
جدول 3-16 ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط پرایمرRP7      66
جدول 3-17  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط کل پرایمرها    68
جدول 3-18  ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط کل پرایمرها    69

فهرست مطالب
چکیده    1
فصل اول : کلیات وبررسی منابع    2
مقدمه     3
1-1 کلیاتی در مورد گیاه مورد مطالعه    5
1-1-1  رده بندی گیاه    5
1-1-2  گیاه شناسی راسته آلاله       Ranunculales        5
1-1-3  گیاه شناسی تیره آلاله       Ranunculacea    5
1-1-4  گیاه شناسی جنس       Anemone    6
1-1-5  گیاه شناسی گونه      Anemone narcissiflora      8
1-1-6  کلید شناسایی زیر گونه ها    narcissiflora و willdenowii    8
1-1-7  اهمیت تیره آلاله    8
1-1-8  ترکبیات شیمیایی گیاهان تیره آلاله    9
1-2  مروری بر روش های نشانگر مولکولی در گیاهان    9
1-2-1  مارکرهای ژنتیکی    10
1-2-2 کاربردهای مارکر های DNA    14
1-3  واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR    15
1-3-1  مراحل PCR    17
1-3-2  کاربرد های PCR    17
1-4 تکنیک RAPD    18
1-4- 1کاربرد آنالیز های RAPD    18
1-4-2  الحاق نشانگر های ژنتیکی توسعه یافته به یک خصوصیت مورد مطالعه    19
1-4-3  جمعیت و توارث ژنتیکی    19
1-4-4 تکرار پذیری نشانگر های RAPD     20
1-4-5  ملاحظات پایانی    20
1-5   بررسی منابع    22
فصل دوم: مواد و روش ها    24
2-1 جمع آوری نمونه ها و آماده سازی آنها    25
2-2 استخراج DNA ژنومی از نمونه مورد مطالعه    28
2-2-1  محلول ها و بافر های لازم برای استخراج DNA    28
2-2-1-1  بافر استخراج    28
2-2-1-2  محلول CTAB / NACL    28
2-2-1-3  بافر  CTAB Percipitation    28
2-2-1-4  بافر High Salt TE     29
2-2-1-5  کلروفورم – ایزوآمیل الکل (24:1)    29
2-2-2  مراحل استخراج DNA  ژنومی از نمونه های گیاهی    30
2-3  بررسی کمیت و کیفیت DNA ژنومی استخراج شده    32
2-3-1 روش الکتروفورز    32
2-3-2 روش اسپکتروفتومتری    32
2-4  محلول ها و بافر های لازم برای الکتروفورز ژل آگارز    33
2-4-1 محلول بافر TBE (10X)    33
2-4-2 محلول بافر TBE (1X)    33
2-4-3 ژل آگارز    34
2-4-4 /DNA Sample Buffer     DNA Loading    34
2-5  الکتروفورز ژل آگارز    34
2-6 واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) با آغازگرهای RAPD    35
2-6-1 مواد و وسایل لازم برای انجام PCR-RAPD    35
2-6-1-1 DFS Master MIX      35
2-6-1-2 آغازگرها    36
2-6-1-3  آب دیونیزه    36
2-6-1-4  DNA الگو    36
2-6-2 واکنش PCR-RAPD    36
2-6-1-2  آماده سازی واکنشگر PCR-RAPD    36
2-6-2-2  چرخه حرارتی   PCR     37
2-7 تهیه ژل آگارز و الکتروفورز فرآورده های تکثیر شده    38
2-8  عکس برداری نمونه ها    39
2-9 تجزیه داده های  RAPD    39
فصل سوم: نتایج    40
3-1  کیفیت و کمیت DNA ژنومی استخراج شده    41
3-2  شرایط بهینه PCR –RAPD     42
3-2-1  غلظت واکنش گرهای PCR –RAPD    42
3-2-1-1  DNA ژنومی    42
3-2-1-2  پرایمرها     42
3-2-2  برنامه دمایی و زمانی بهینه جهت انجام PCR    42
3-3  الگوی باندی حاصل از PCR –RAPD    44
3-4  داده های حاصل از PCR –RAPD    44
فصل چهارم:  نتیجه گیری کلی و بحث    60
4-1 نتیجه گیری کلی و بحث    61
پیشنهادات    64
منابع     65

فهرست جدول ها
جدول 2-1 نمونه های مورد مطالعه و مشخصات گیاه شناسی    25
جدول 2-2  مواد لازم برای تهیه بافر استخراج DNA ژنومی    28
جدول 2-3  مواد لازم برای تهیه بافر CTAB Percipitation    29
جدول 2-4 مواد لازم برای تهیه بافرHigh Salt TE    29
جدول 2-5  مواد لازم برای تهیه/ DNA Sample Buffer     DNA Loading    34
جدول 2-6  نام وتوالی آغازگرهای RAPD    36
جدول 2-7  چرخه حرارتیPCR       37
جدول 3-1  نتایج نانودراپ    41
جدول 3-2  غلظت واکنش گرهای مربوط به پرایمر ها     42
جدول 3-3  دمای اتصال ودرصد GC مربوط به پرایمرها    43
جدول 3-4  برنامه، دما وزمان لازم جهت انجام PCR برای پرایمر هایRP1 ، RP2، RP3، RP4،RP6 ،                RP7    43
جدول 3-5  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP1    45
جدول 3-6  ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD توسط پرایمرRP1     45
جدول 3-7 کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP2    47
جدول 3-8  ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD توسط پرایمرRP2    47
جدول 3-9  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP3    49
جدول 3-10 ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط پرایمرRP3      49
جدول 3-11  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP4    51
جدول 3-12 ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط پرایمرRP4      51
جدول 3-13 کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP6    53
جدول 3-14 ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط پرایمرRP6      53
جدول 3-15  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط RP7    55
جدول 3-16 ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط پرایمرRP7      55
جدول 3-17  کدگذاری بر اساس وجود یا عدم وجود باند توسط کل پرایمرها    57
جدول 3-18  ماتریس فاصله ژنتیکی برای نمونه های مورد مطالعه بر اساس الگوی باندی RAPD  توسط کل پرایمرها    58


فهرست شکل ها

شکل1-1  نقشه مکان اصلی گیاه مورد استفاده در این تحقیق    21
شکل 2-1  گل آذین های 1 تا 7 تایی    26
شکل 2-2  نمایی از پودر کردن مواد گیاهی    27
شکل 2-3  دستگاه نانودراپ برای تعیین کمیت DNA    33
شکل2-4  دستگاه ترموسایکلر    37
شکل 2-5  دستگاه الکتروفورز افقی    38
شکل 2-6  دستگاه ژل داک    39
شکل 3-1 الگوی باندی DNA ژنومی استخراج شده روی ژل 1 %    41
شکل 3-2  نمونه الگوی باندی حاصل از الکتروفورز محصول PCR-RAPD توسط پرایمرRP6     44
شکل3-3  دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمر RP1    46
شکل3-4   دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP2    48
شکل3-5  دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP3    50
شکل 3-6 دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP4    52
شکل 3-7 دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش  UPGA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP6    54
شکل3-8  دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS مربوط به پرایمرRP7    56
شکل3 -9  دندروگرام فاصله ژنتیکی نمونه مورد مطالعه و گروه بندی آنها بر اساس روش UPGMA به کمک نرم افزارNTSYS کل پرایمر    59

 
چکیده
گونه Anemone narcissiflora متعلق به جنس  Anemone از تیره Ranunculaceae می باشد. این گونه دارای دو زیر گونه با نام های narcissiflora و willdenowii است که زیر گونه willdenowii در سال 89 برای ایران رکورد زده شد. به منظور مطالعه تنوع ژنتیکی گونه Anemone narcissiflora  با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD ، تعدادی نمونه از منطقه کوه کمر زنوز واقع در استان آذربایجان شرقی جمع آوری شد و تنوع ژنتیکی نمونه ها با استفاده از 6 آغازگر تصادفی 10 نوکلئوتیدی با روش PCR-RAPD بررسی شد. از 6 آغازگر به کار رفته در این تکنیک 39 باند پلی مورفیک تولید شد که بیشترین باند دهی مربوط به آغازگر RP1  و کمترین باند دهی مربوط به RP7 می باشد و متوسط باند دهی برای هر پرایمر 5/6 باند پلی مورفیک بود. آنالیز خوشه ای نمونه ها به روش UPGMA با استفاده از نرم افزار NTYSYSpc 2.02 انجام گرفت. دندروگرام حاصل از مهاجرت باندها نشان داد که نمونه های مورد مطالعه را می توان به دو گروه تقسیم کرد که گروه اول شامل نمونه های یک گلی و دو گلی و گروه دوم خود شامل دو زیر گروه می باشد که زیر گروه اول شامل نمونه های سه گلی، چهار گلی و پنج گلی و زیر گروه دوم شامل نمونه های شش و هفت گلی می باشد. نتایج حاصل از مقایسه و آنالیز داده های به دست آمده از تکنیک RAPD و ماتریس تشابه، نشان دهنده تنوع ژنتیکی بین نمونه های جمع آوری شده بود. این مطالعه نشان می دهد که نشانگر های RAPD می توانند پلی مورفیسم بین ژنوتیپ های مختلف Anemone narcissiflora و هیبرید های آنها را تعیین کنند. بنابراین تکنیک RAPD می تواند به عنوان یک روش مولکولی مناسب برای تعیین تنوع ژنتیکی نمونه های مورد مطالعه مورد استفاده قرار گیرد.


فصل اول
کلیات و بررسی منابع

 
مقدمه
گونه  Anemone narcissiflora از تیره Ranunculaceae در سال 89 توسط اکرمی و مظفریان در مقاله ای با عنوان :  A New Species Of Hedysarum (Fabaceae) And A New Record Of Anemone (Ranunculaceae) From NW IRAN  برای ایران رکورد زده شده است و تا کنون تحقیقات  مولکولی بر روی این گیاه صورت نگرفته است(11) .
جنسAnemone  در جهان شامل 118 گونه می باشد که اکثر گونه ها ی آن در نیمکره شمالی هستند و در نواحی کوهستانی و سرد نیمکره جنوبی و نواحی با ارتفاع زیاد و نواحی مدیترانه ای نیز دیده می شود(8).
امروزه جهت تعیین تنوع ژنتیکی بین جمعیت های حفاظت شده علاوه بر شیوه سنتی که مبتنی بر خصوصیات مورفولوژیکی می باشد، از ابزار و نشانگر های نوین مولکولی از جمله نشانگرهای DNA استفاده می شود.  لذا میزان چند شکلی بدست آمده از این نشانگرهای ژنتیکی، یکی از پارامترهای قابل ارزیابی برای مطالعه جمعیت ها  و درک تفاوت های ژنتیکی بین آنها محسوب می شود.  نشانگرهای DNA مبتنی برچند شکلی طبیعی درDNA  هستند که اساس بهره برداری اهداف کاربردی را تشکیل می دهند( 1). نشانگر های DNA  در مدت یک دهه از آغاز  پیدایش، تکاملی شگرف و تحسین بر انگیز داشته اند. انواع مختلف نشانگر های DNA با تفاوت های زیادی از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه کاربرد، امتیاز بندی و تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع و معرفی گردیدند. بدون تردید ابداع و معرفی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR ) بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگر DNA داشته است. تکنیک RAPD بر مبنای PCR یکی از فن آوری های جدید نشاگر های DNA است که در سال 1990 ابداع گردیده است (32) .
به خاطر دقت، سرعت، نیاز به مقدار DNA ژنومی کم، عدم نیاز به شناخت ترادف خاصی از DNA ژنومی برای ساختن پرایمر، عدم نیاز به مواد نشاندار و صرف هزینه کم در تکنیک RAPD ، این تکنیک یکی از مارکرهای مناسب در مطالعه گیاهان می باشد، غالب بودن و عدم تکرار پذیری و همچنین عدم تشخیص سیستم آللی از معایب بزرگ آن می باشد ( 2 و 3).
عوامل مختلف محیطی می توانند بر روی ساختار ژنتیکی جمعیت های یک گونه گیاهی اثر داشته باشند. این مطالعه تنوع ژنتیکی جمعیت گونه Anemone narcissiflora    رابا استفاده از تکنیک PCR-RAPD  بررسی می کند.
هدف کلی از این تحقیق بررسی دقیق رده بندی فرو گونه ای جمعیت های مختلف Anemone narcissiflora در آذربایجان است که در صورت یافتن یک زیر گونه جدید، کلید شناسایی جدیدی برای زیر گونه نوشته خواهد شد.


1-1 کلیاتی در مورد گیاه مورد مطالعه                                       
1-1-1    رده بندی                           
Kingdom : Plantae
Division : Magnoliophyta
Class : Magnoliopsida
Order : Ranunculales
Family : Ranunculaceae
Genus : Anemone
Species : Anemone narcissiflora L.
Sub Species : Anemone narcissiflora ssp.willdenowii

منابع
1-  جداری کوهی ب، گروسی ق، حسینی ر. 1390 .بررسی تنوع ژنتیکی در ارقام بی دانه انگور توسط نشانگر ملکولی RAPD . مجله سلول و بافت ، جلد 2 :106-99.
2- حسین زاده کلاگر ا ، برزگر ع. 1387 .تنوع ژنتیکیAscochyta rabiei  با استفاده از استاندارد نمودن RAPD. مجله علوم کشاورزی و منابع طبیعی ، جلد15  شماره اول.
3- سرخوش ع، زمانی ذ، فتاحی مقدم م، عبادی ع. 1384 .بررسی تنوع ژنتیکی برخی از ژنوتیپ های انار با استفاده از نشانگر (RAPD) . چهارمین همایش ملی بیو تکنولوژی جمهوری اسلامی ایران ،کرمان مرداد
4- طباطبایی م ، ملکی راد ع ا. 1388 . روش های تشخیص مولکولی در ژنتیک (ترجمه) .انتشارات نیک تهران. 152 صفحه.
5- طباطبایی م، عبدالهی م ر. 1388 . اصول زیست شناسی و ژنتیک (ترجمه). انتشارات نیک تهران. 248 صفحه.
6- قاسمی نژاد م ، بازوبندی م، کریمی شهری م. ر، نیکخواه م. ح. 1390 .بررسی تنوع ژنتیکی علف قناری(Phalaris minor Retz.) با استفاده از نشانگر های مولکولی RAPD . فصلنامه بوم شناختی علف های هرز ، جلد2، شماره1، ص: 1-10.
7- کریمی ه.87 13. فرهنگ رستنی های ایران.جلد2، انتشارات علوم کشاورزی ایران.91 صفحه.
8- مظفریان و.90 13. رده بندی گیاهان ، دو لپه ای ها. جلد2، انتشارات امیر کبیر تهران. ویرایش اول چاپ پنجم،610 صفحه.
9- نقوی م ، قره یاضی ب ، سالکده ق. 1384 .نشانگرهای مولکولی دانشگاه تهران. موسسه انتشارات و چاپ دانشگاه تهران. 360 صفحه.
10- یزدی صمدی ب ، ولی زاده م. 1380 .ژنتیک از دیدگاه مولکولی (ترجمه). انتشارات دانشگاه تهران. 447 صفحه.
11- Akrami S? Mozaffarian V? Maassoumi A? Nejadsattari T. 2011. A new species of  Hedysarum (Fabaceae) and a new record of Anemone (Ranunculaceae) from NW IRAN. Iran. J. Bot. 17(1) :20-23. Tehran.
12- Bardakci F.2000. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Turk J Biol . 25(2001) : 185-196
13- Davis P.H. (Ed). 1985. flora of Turkey and the Aegean Island.? Edinburgh….
14- Dole J? Healy W. 1914 . Producting  Anemone as a cut flower. Maryland Cooperative Extension. Fact Sheet 753.
15- Hoot S? Reznicek A. 1994. Phylogenetic Relationships in Anemone
(Ranunculaceae) based on morphology and chloroplast DNA. Systematic botany?19(1):pp.169-200.
16-Iranshahr M? Rechinger K H? Riedl H. 1992. Flora Iranica? Ranunculaceae – VOL.171. Akademische Druck und Verlagsanstalt?  Graz Austria.
17- Ithaca NY. 2005. Herbalists View; Anemone for Pani Attacks.Northeast school of  botanical medicine. P.O.Box 6626.
18- Iqbal  MJ?  Aziz N? Saeed NA? ZafarY? Malik KA. 1997. Genetic diversity evalution of some elite cotton varieties by RAPD analysis.Theor Appl Genet.94:139-144.
19- Jermyn  J.2005. Alpine plants of Europe Timberpress.
20- Kadva Sh? Yadav M? Tiwari A. 2012. Genetic Analysis on Hibiscus Species by Using RAPD Markeras.International Journal of Biomedical and Advance Research.India.473-485.
21- Laura M? Lazzari B? Bobbio V? Caprera A? Borghi C? Strozzi F? Allavena A ?  Stella A. 2011.De novo sequencing of Anemone coronaria transcriptome to discover putative genes involved in tranzechelia discolour infection response. Proceedings of  the Joint Meeting AGI-SIBV-SIGA.Italy.ISBN 978-88-905470-2-9.
22- Meyer K? Hoot  S? Arroyot  M. 2010. Phylogenetic affinities of  south american  Anemone (Ranunculaceae),including  the endemic segregate genera,barneoudia and oreithales. Int. J . Plant Sci.171(3):323-331.
23- Mohammad Rawashdeh  I. 2011. Genetic diversity analysis of Achillea fragrantissima (Forskal) Schultz  bip populations collected from different regions of  jordan using RAPD markers. Jordan journal of   biological sciences. P:21-28.
24- Naturalium R. 2009. Mutation  dynamicc and phylogenetic utility of plastid introns and spacers in early branching  eudicots. Institut For  botanik angefertigt.
25- Ozdemir C? Altan Y? Baran  P? Aktash  K. 2008. Morphological and anatomical studies on medicinally and economically impotant Anemone narcissiflora L. subsp.narcissiflora (Ranunculaceae). Research journal of agricultur and biological sciences? 4(6):875-880.
26- Perveen A? Qaiser M. 2006. Pollen Flora of Pakistan-L. Ranunculaceae . Pak. J. Bot.? 38(3):499-509.
27- Romesburg HC. 1990.Cluster analysis for researchers. Krieyer publishing? malabar?FI? UA.
28- Semagn k? Bjornstad A, Ndjiondjop MN. 2006. An overview of molecular marker methods for plants . African journal of  biotechnology.Vol. 5 (25) pp. 2549-2568.
29- Skoric M? Siler B? Banjanac T? Zivkovic J? Dmitrovic S? Misic D? Grubisic D. 2012.The reproducibility of  RAPD profiles: Effects of  PCR components on RAPD analysis of  four centaurium species. Arch. Biol. Sci.? Belgrade? 64(1)? 191-199.
30- Sun M? Yin X? Shi F? Li L? Li M? Li L? Xiao H. 2012. Development  of eighteen microsatellite markers in anemone amurensis (Ranunculaceae) and cross-amplification in congeneric species.Int. J. Mol. Sci. 13?4889-4895.
31- Verheyen K? Hermy M? Graa  BJ. 2011. An  intraspecific application of the leaf-height- seed ecology strategy scheme to forest herbs along a latitudinal gradient. Ghent University, Laboratory of  Forestry.p:132-140.
32- Williams J? Kubelik A? Livak K? Raflski J? Tingey S.1990. DNA polymorphismsamplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.Nucleic Acids Research? vol.18? No.22.
33- Ying C? Li SH. 2009. Molecular phylogeny of  Ranunculaceae based on internal transcribed spacer sequences.African Journal of Biotechnology vol. 8(20)? pp.5215-5224.
34- Ziman  S? Bulakh E? Tsarenko O. 2011. Anemone L. (Ranunculaceae): comparative morphology and taxonomy of the species from the Balkan flora.Botanica serbica 35(2):87-97.


Abstract
species of Anemone narcissiflora is belonged to Anemone genus of Ranunculaceae family. this species has two subspecies named narcissiflora and willdenowii which the latest is recorded in iran in 2010. some samples of Anemone narcissiflora is gathered from kuhkamar, zonouz region of east azarbayjan province, iran to study the genetic diversity of the species by using RAPD molecular markers, and estimation of genetic diversity were evaluated by using 6 random primers with 10 nucleotides by using PCR-RAPD method.  39 polymorphic bands were produced from the six primers used in this technique that the maximum band is related to the RP1 primer, the lowest band is related to the RP7 and the average band for all primers were 6.5 polymorphic bands. cluster analysis of samples in done by upgma method in ntysyspc 2.02 software. dendrogram resulting from migrating bands showed that the studied samples can be divided into two groups. the first group includes samples of one flower
and two flower and the second group consists of two sub-groups which the first subgroup consists of three flowers, four flowers and five flowers samples, and the second subgroup consists of six and seven flower samples. the results of the comparison and analysis of the data obtained from rapd technique and similarity matrix represents the genetic variation between collected samples. this study shows that rapd markers can determine the polymorphisms between different genotypes can of  Anemone  narcissiflora  and their hybrids. so RAPD technique can serve as a suitable molecular method to determine the genetic diversity of samples.
Kay Words: Anemone  narcissiflora, Genetic Diversity, RAPD-PCR